纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚复合材料引导性骨再生膜管修复股骨大段骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.004

中国组织工程研究 ›› 2017, Vol. 21 ›› Issue (10): 1495-1500.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2017.10.004

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纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚复合材料引导性骨再生膜管修复股骨大段骨缺损

杨红胜，曹宗锐，严小虎，李育刚，许泽川，常山

成都医学院第一附属医院脊柱外科，四川省成都市 610500

收稿日期:2017-01-10 出版日期:2017-04-08 发布日期:2017-05-08
通讯作者: 常山，硕士，主任医师，教授，成都医学院第一附属医院脊柱外科，四川省成都市 610500
作者简介:杨红胜，男，1985 年生，山东省曲阜市人，汉族，2012年四川大学华西临床医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事脊柱四肢创伤及骨肿瘤研究。
基金资助:
四川省教育厅资助项目(CYZ12-008，13ZB0232)；四川省卫生和计划生育委员会资助项目(130395)

Guided bone regeneration membrane tube made of nano-hydroxyapatite/multi(amino acid) copolymer in the repair of large segmental bone defects

Yang Hong-sheng, Cao Zong-rui, Yan Xiao-hu, Li Yu-gang, Xu Ze-chuan, Chang Shan

Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical University, Chengdu 610500, Sichuan Province, China

Received:2017-01-10 Online:2017-04-08 Published:2017-05-08
Contact: Chang Shan, Master, Chief physician, Professor, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu 610500, Sichuan Province, China
About author:Yang Hong-sheng, Master, Attending physician, Department of Spinal Surgery, the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical University, Chengdu 610500, Sichuan Province, China
Supported by:
a grant from Sichuan Provincial Department of Education, No. CYZ12-008, 13ZB0232; a grant from Sichuan Provincial Health and Family Planning Commission, No. 130395

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
大段骨缺损：由创伤或肿瘤导致的长骨大段骨缺损是骨科研究的难题，其最小临界值为长骨横径的1.5倍以上是目前共识。近几年对于该问题的研究热点集中在组织工程技术、引导性骨再生、人工骨替代材料和细胞因子的研究等方面，但各项研究均存在一定限制，难以一劳永逸解决该难题。因此对于大段骨缺损修复的相关研究仍具有重要意义。
引导性骨再生：近几年，膜引导性骨再生技术已经成为修复动物节段性骨缺损的新兴方法。其作用机制为将隔膜放置于骨缺损区作为机械屏障，阻止非成骨性细胞向缺损内侵入，为成骨创造生长空间，允许成骨性细胞优先迁移、生长，利用膜管的屏障作用，促进膜管下的新骨再生、重塑和改建。

背景：大段骨缺损的修复问题仍然是骨科医师面对的重要难题，同种异体骨移植是经典的治疗方案，但存在诸多限制，引导性骨再生技术的骨重建再生效果成为研究该课题的重要思路和方法。
目的：比较自制高强度可降解纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚复合材料引导性骨再生膜管与同种异体皮质骨段修复山羊股骨大段骨缺损的效果。
方法：建立32只成年山羊股骨中段30 mm大段骨缺损模型。实验组采用自制纳米羟基磷灰石/多氨基酸共聚复合材料膜管桥接骨缺损并采用接骨板固定，对照组采用同种异体皮质骨段桥接并结合接骨板固定。于术后4，8，12，16周处死动物，观察大体标本骨痂生长情况，并行X射线、组织学观察；术后12，16周对钢板固定皮质骨段行生物力学测定。
结果与结论：①术后4-16周，2组大体标本及病理结果均提示膜管内外侧有纤维骨痂生长，并逐渐硬化成为骨性骨痂，但实验组骨痂生长更多；X射线片见纳米羟基磷灰石/多氨基酸共聚复合物膜管外侧骨痂密度增高较同种异体骨管更为明显；②16周时实验组最大抗弯曲强度显著高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)；③综上，纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚复合材料膜管桥接山羊大段骨缺损可取得与同种异体皮质骨段移植相仿的修复效果，且愈合后新生骨段的力学强度优于同种异体移植骨段。

ORCID: 0000-0002-8679-0511(杨红胜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚物, 骨缺损, 同种异体皮质骨段, 骨移植

Abstract:

ACKGROUND: Treatment of large bone defects is an important problem faced by orthopedic physicians. Allogeneic bone transplantation is a classic method, but it has many restrictions. The membrane guided bone regeneration technique has become an important method for the research nowadays.
OBJECTIVE: To compare the effects of self-made high strength biodegradable nano-hydroxyapatite/multi(amino acid) copolymer (n-HA/MACP) guided bone regeneration membrane tube and allograft bone graft segment in the repair of large segmental bone defect in goats.
METHODS: The model of 30 mm large segment bone defect in the middle section of the femur in 32 adult goats was established. Experimental group used self-made n-HA/MACP tube to bridge defects following bone plate fixation. The control group was treated with allograft bone graft bone segments combined with plate fixation. The animals were sacrificed at 4, 8, 12 and 16 weeks after operation, and the bone callus growth was observed in the specimens. The X-ray and histological observations were performed at the same time. Biomechanical measurement of plate fixation of allograft cortical bone segment was done at 12 and 16 weeks after operation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) After 4 to 16 weeks, gross and pathological results showed fibrous callus growth inside and outside of the membrane tube, and the fibrous callus gradually hardened into a bony callus. Additionally, the callus was larger in the experimental group than in the control group. X-ray films showed significantly increased lateral callus density in the experimental group as compared with the control group. (2) Maximum bending strength was significantly higher in the experimental group than in the control group at 16 weeks (P < 0.05). Overall, the n-HA/MACP membrane tube used for bridging large segment bone defects in goats can obtain similar repair effects to the allograft cortical bone, and further achieve the better mechanical strength of the new bone segment than the allograft bone.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Femur, Hydroxyapatites, Amino Acids, Bone Transplantation, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

杨红胜，曹宗锐，严小虎，李育刚，许泽川，常山. 纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚复合材料引导性骨再生膜管修复股骨大段骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(10): 1495-1500.

Yang Hong-sheng, Cao Zong-rui, Yan Xiao-hu, Li Yu-gang, Xu Ze-chuan, Chang Shan . Guided bone regeneration membrane tube made of nano-hydroxyapatite/multi(amino acid) copolymer in the repair of large segmental bone defects[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(10): 1495-1500.

图/表（结果） 4

2.1 参与者数量分析 32只山羊随机分为2组，所有实验动物术后均成活良好，无意外死亡，伤口愈合良好，无红肿、积液、感染，术后10-12 d全部拆线。无手术后再骨折，内固定系统无移位、断裂等情况。

2.2 X射线观察结果术后4周，实验组膜管与股骨接触两端可见较为均匀的云雾状密度影，膜管无塌陷移位；对照组同种异体骨管两端也可见云雾密度影，但实验组更为明显。

术后8周，实验组膜管外有明显骨痂生长、膜管内出现较多均匀密度影，膜管无异常；对照组同种异体骨管密度稍降低、骨管两端骨折线模糊、管内出现不均匀密度影。

术后12周，实验组膜管表面骨痂继续生长、增厚，骨缺损区内密度增加，两端可见呈帽状生长的骨皮质密度影，膜管位置良好，无移位；对照组骨痂生长较8周时稍增多，异体骨管两端与宿主骨开始融合，异体骨管密度有所增加。

术后16周，实验组股骨中段大量骨痂生长，骨痂包裹于膜管及钢板周围膜管与股骨连成整体，骨痂呈皮质骨样密度影像；对照组移植骨与宿主骨已完全连接，骨髓腔再通，整体塑形良好，对照组整体外骨痂量明显较实验组少(图1)。

2.3 大体标本观察结果实验组和对照侧动物各时间段被处死后观察，植入物周围无化脓、积液或坏死等迹象。

术后4周，实验组及对照组骨缺损两端有少量骨痂形成，膜管及同种异体骨管未被包裹，均与山羊股骨边界清楚，无明显连接。膜管及骨管均无塌陷、移位，管腔内外可见机化的血肿。

术后8周，实验组膜管内外均有见大量骨痂生长，以两端最明显，有部分骨痂开始向膜管表面爬行，膜管位置良好，管腔内有软骨样组织形成。对照组同种异体骨管外表面有较多骨痂生长，但异体骨段仍然未于股骨连接，管腔内成骨不明显。

术后12周，实验组膜管表面骨痂大量生长，膜管及接骨板完全被包裹，且骨痂在局部形成突起，膜管、骨痂与股骨连成整体，骨痂呈皮质骨硬度。对照组骨管表面少量骨痂形成，整体外骨痂量明显较实验组少，异体骨段与股骨靠骨痂连接。

术后16周，实验组膜管表面骨痂较12周更多，膜管内外均有再生皮质骨将缺损两端相互连接；对照组移植骨与宿主骨已完全连接，骨髓腔再通，骨痂塑形良好，但整体外骨痂形成较实验组少(图2)。

2.4 骨痂组织学观察术后4周，实验组膜管桥接端开始出现肉芽组织及新生细小骨小梁。骨小梁成骨细胞增生活跃，间质中肉芽组织血管丰富，管腔内见陈旧性机化血凝块组织及新生毛细血管形成。对照组同种异体骨管内外均有肌纤维结缔组织长入。骨管开始出现骨吸收陷窝，陷窝内见肉芽组织形成及新生骨小梁长入，骨管内见新生肉芽组织形成。

术后8周，实验组膜管外见大量骨痂形成，骨小梁增粗，间质开始纤维化，并出现新生软骨细胞岛及软骨内成骨现象，膜管内部见纤维骨痂形成；对照组，同种异体骨管管壁骨吸收增多，新生骨小梁长入，异体骨管腔内外见新生骨小梁。

术后12周，实验组膜管外见大量骨性骨痂，骨小梁粗大成网格状，骨痂开始塑形成板层骨，板层骨排列紊乱、无序，膜管内骨小梁形成，间质出现新生骨髓成分及髓腔形成，膜管与内外骨痂紧靠但无明显连接(图3A)；对照组骨小梁增厚，与异体骨管融合，管腔内骨小梁增多，骨髓腔再通(图3B)。

术后16周，实验组膜管外骨板形成、塑形，板层骨排列整齐、有序，膜管内骨断端有不规则骨形成，髓腔再通(图3C)；对照组移植骨与宿主骨已完全连接，骨髓腔再通，整体塑形良好(图3D)。

2.5 生物力学测试结果结果提示，12周时实验组最大抗弯曲强度较对照组稍高，但统计学分析差异无显著性意义(P > 0.05)；16周时实验组最大抗弯曲强度显著高于对照组，差异有显著性意义(P < 0.05)。具体数据见表1。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。

1.2 时间及地点于2014年7月至2015年3月在成都医学院第一附属医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物取健康中国成年山羊32只，约12月龄，体质量为15-20 kg，雌雄不限，由成都医学院第一附属医院中心实验室提供，许可证号：SYXK(川)2015-196。

1.3.2 主要设备和仪器 8孔钛合金重建接骨板(江苏艾迪尔医疗科技有限公司)；直径3.5 mm皮质骨螺钉，长度16-30 mm(江苏艾迪尔医疗科技有限公司)；内固定手术器械：电钻、直径3.5 mm丝攻、持骨钳、骨刀、骨锤、钻头、3.5 mm螺丝刀(上述器材由成都万家同器械有公司提供)。切片机(LEICARMZ145德国)、光学显微镜(OLYMPUS日本)、扫描电子显微镜(AMRAY-1000B，美国)、X射线机(Z8000，德国其木)、生物力学实验机(REGER 3050，日本)、统计软件(SPSS 19.0)。

1.3.3 膜管材料膜管由n-HA/MACP材料制备而成(成都国纳科技有限公司提供材料，并制备成型)，规格：直筒型，外直径19 mm，长36 mm，膜管壁厚3 mm。

1.4 方法

1.4.1 动物模型的建立及分组干预 n-HA/MACP膜管由环氧乙烷灭菌并密封保存备用。取新鲜山羊股骨干部分，去除骨髓及表面骨膜、肌肉，制作成30 mm长的骨管，生理盐水冲洗，碘伏溶液浸泡24 h，制成同种异体皮质骨管，-20 ℃下冷冻保存备用。

山羊共32只，分别编号，按抓阄法随机分为实验组和对照组(n=16)，实施手术前亦随机选择左侧或右侧股骨。实验组修复及固定方法选择n-HA/MACP膜管+钛合金接骨板；对照组选择同种异体骨管+钛合金接骨板。

1.4.2 修复手术过程选择插管全麻，先行实验组动物手术，常规消毒铺巾，行手术侧股骨中段外侧切口8 cm，沿肌间隙分离直至股骨中段，剥离股骨外侧软组织及骨膜，显露股骨中段，制作30 mm长骨缺损，冲洗骨缺损端，将膜管放置于骨折断端(两骨端分别深入膜管内3 mm)，8孔重建钢板固定股骨，膜管不固定，大量生理盐水冲洗后缝合、包扎伤口。同样的方法行对照组手术，固定方式选择同种异体骨段移植，并使用8孔重建钢板固定股骨及同种异体骨段。

1.4.3 植入后处理手术肢体用管形石膏固定1周，分笼喂养。前3 d每天给予头孢唑林500 mg肌注。每两至三天换药1次，伤口愈合良好后拆线。

1.5 主要观察指标观察术后山羊情况，并记录伤口愈合情况，于术后4，8，12，16周对2组手术侧股骨行X射线观察；每次每组随机选择4只山羊处死，剥除固定股骨处软组织，观察大体标本骨痂生长情况，并行组织学观察；术后12，16周处死的动物拆除接骨板，对固定节段的皮质骨段行最大抗弯曲强度测定。

最大抗弯曲强度测定：将术后12，16周时2组处死动物的股骨取出，剔除软组织，拆除内固定后见2组标本骨皮质连续性良好，均无内固定松动断裂、拆除后骨折等情况发生。将标本于-20 ℃低温冰箱保存，实验前2 h取出股骨标本于室温下自然解冻，进行破坏性3点弯曲测试，样本数均为4。测试条件为：温度26 ℃，湿度45%(压力探头放置于骨缺损中点部位，压力方向与螺钉固定方向垂直，两侧承力点完全钢板固定距离远近端以外，保持跨距50 mm)。

1.6 统计学分析由第一、二作者对统计数据进行分析，生物力学实验数据用x(_)±s表示，统计学分析选择t 检验，应用SPSS 19.0统计软件处理，P < 0.05认为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

目前对于长骨大段骨缺损的临界范围尚无统一结论^[8]，国内外学者较为普遍的认识是长骨骨缺损长度大于其直径的1.5倍以上时即可认定为大段骨缺损范畴^[9-10]。本实验前期研究已经对12个月龄中国山羊股骨中段进行解剖学参数测量，证实股骨中段段直径为(14.5±4.0) mm，故本实验制定的山羊股骨中段30 mm节段性骨缺损模型属于大段骨缺损的范围。大段骨缺损发生后，机体开启组织的修复程序，但各部分组织再生的速度不同，周围软组织的成纤维细胞修复速度远大于具有成骨功能的细胞想骨缺损内生长的速度，若不采取措施阻止成纤维细胞长入，因纤维组织的阻隔，骨缺损处易发生骨不连^[10]。早在1988年Dalin等^[11]就指出，骨缺损两骨端间的成骨速度必须超过骨折周围纤维组织生长速度，才能确保骨折断端不被纤维组织嵌入阻隔，骨再生才能顺利进行。膜引导性骨再生技术就是在骨缺损区放置隔膜作为一种机械屏障，阻止非成骨性细胞向缺损内侵入，为成骨创造生长空间，允许成骨细胞优先迁移、生长。利用膜管的屏障作用，促进膜管下的新骨再生、重塑和改建，已经成为修复动物节段性骨缺损的新兴方法。综合国内外文献报告结果，其作用机制主要包括：机械屏障作用^[5，12]、传导作用、骨诱导作用^[6，13-14]、保护及稳定血肿^[15]、促进骨微循环系统重建、载体作用等^[16-17]。但检索文献也容易发现以下阻碍膜引导性骨再生技术应用于临床的难题：①膜管初始机械强度不足，难以保持足够的膜管下容积，不能形成足量的新生骨修复骨缺损^[18-19]；②植入的膜管稳定性差，长管状骨节段性骨缺损部位所存在的复杂的应力作用导致膜管扭曲、移位、松动，不能与新骨紧密结合，难以良好保护膜管下新骨再生、重塑和改建^{[12，15，20-29]}。

本实验所采用的膜管制备材料是由四川国纳科技有限公司研制的新型的高分子聚合材料——n-HA/MACP，由多种氨基酸材料与天然无机材料羟基磷灰石聚合而成的新型生物可降解复合材料，两者均来源广，易于获得，复合物聚合过程较简单，易于操控，塑形好，可用来做成各种形状^[30-31]；降解产物为中性，不会引起无菌性炎症，降低了感染风险^[32-33]；以羟基磷灰石晶体复合胶原蛋白的纳米结构排列与天然骨组织结构极为相似，有利于成骨细胞在膜管表面附着、分裂增殖和分化，沿膜管内外壁爬行，引导骨痂由骨缺损两端向中间生长^[34-35]。同时，膜管也聚集了内源性的生长因子，有利于膜管内血肿向骨痂的转化。本实验外侧骨痂较膜管内骨痂更多，可能与n-HA/MACP良好的支架作用和材料本身的诱导性骨再生作用较膜内成骨作用更为明显。同时n-HA/MACP复合物以表面降解为主，力学强度不会随着降解过快丢失，是一种安全、无毒、表面微降解的新型生物医学材料^[36-39]。本实验中所有植入的膜管周围无严重不良反应，动物无意外死亡，手术伤口愈合良好，证实由n-HA/MACP制备的膜管生物安全性及生物相容性好。

实验所采用的引导性骨再生系统，在配合接骨板固定的前提下，骨断端插入膜管内3 mm，由此构成的固定系统既保证了缺损处的初始稳定性，又因为膜管良好的机械强度，在骨痂生长、塑形的整个阶段可提供良好的力学支撑效果，为引导性骨再生提供充分的空间支撑。16周的动物实验证实，在手术后动物正常活动情况下，植入的膜管下无碎裂、塌陷，膜管下容积无减小，为骨再生提供了充足的空间。同时n-HA/MACP材料本身具备的可降解性及骨诱导作用在实验中亦表现明显：手术后第4周开始，组织学检查提示膜管内外开始有血肿机化和纤维骨痂生长，X射线片上出现两骨断端的轻度骨膜反应，第8周时骨痂生长较对照组增多，形成组织学上的骨性骨痂，且外侧骨痂生长更多，较对照组更为明显。12周时可完成骨缺损段的修复，膜管外骨痂的生长明显多于同种异体骨移植组，可将骨缺损端连接。但从生物力学的结果分析，2组在12周时抗弯曲力学强度差异无显著性意义，考虑与膜管内外骨痂塑形未完全完成及膜管和骨痂之间的界面整合力学强度未达到最优化有关。随着膜管内外侧新生骨塑形完成，组织学表现为成熟的皮质骨，且实验组较对照组有更大量的骨痂生长、包裹及膜管与成熟骨痂的界面整合更加紧密，在16周时最大抗弯曲力学强度大于对照组，2组比较差异有显著性意义。

本实验证实，n-HA/MACP膜管在配合钛合金接骨板固定后，可提供较好的初始稳定性，引导成骨性细胞优先向缺损内迁移、生长，为这些成骨性细胞增殖、分化创造良好的条件，因膜管自身良好的骨诱导再生效果，于膜管外形成外生性骨痂，以促进骨愈合，骨痂塑形完成后，膜管修复组力学强度大于同种异体骨移植修复组。可以认为，n-HA/MACP膜管在大段骨缺损的治疗中可达到良好的引导性骨再生效果，具有较好的临床应用前景。但本实验缺少膜管体内降解和裂变规律数据，且术中使用接骨板固定，未能解决不吸收接骨板需二次手术取出的问题，故还有待进一步研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

纳米羟基磷灰石/多元氨基酸共聚复合材料引导性骨再生膜管修复股骨大段骨缺损

Guided bone regeneration membrane tube made of nano-hydroxyapatite/multi(amino acid) copolymer in the repair of large segmental bone defects

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